Apesar de descrita há mais de 200 anos (1884) por Christian Gram, a coloração de Gram é uma ferramenta rápida e barata de diagnóstico do tipo de parede celular da bactéria em estudo, ainda amplamente utilizada.

A técnica consiste basicamente nas seguintes etapas:
  1. Preparar uma lâmina de vidro com uma fina camada de bactérias fixa (esfregaço);
  2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
  3. Cobrir com lugol por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
  4. Descorar com solução de álcool-acetona por 30 segundos. Enxaguar em água corrente;
  5. Contra-corar com safranina (ou fucsina) por 30 segundos. Enxaguar em água corrente.
  6. Deixar secar ao ar.
 Uma bactéria é dita Gram negativa quando sua parede celular é incapaz de reter o corante cristal violeta, sendo corada somente pela safranina ou fucsina, que empresta sua coloração rosa às bactérias.
Já uma bactéria do tipo Gram positiva possui uma parede celular capaz de reter o cristal violeta, e por isso adquire coloração roxa ao microscópio.
Veja no esquema abaixo os passos da coloração e o que acontece a nível microscópico:
  A figura abaixo mostra exemplos de bactérias, como são vistas ao microscópio, após sofrerem a coloração de Gram:
A coloração de Gram se baseia em algumas diferenças estruturais existentes entre a parede celular de uma bactéria Gram negativa e de uma Gram positiva. A principal delas é que a parede celular de uma bactéria Gram positiva, embora mais espessa, é quimicamente mais simples, ou seja, apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula (90% peptidioglicano). Veja figura abaixo:

Já a parede celular de uma bactéria Gram negativa é mais complexa. É formada por uma ou poucas camadas de peptidioglicano e por uma membrana externa, separadas entre si por um espaço periplásmico, contendo uma série de enzimas e proteínas. Enquanto nas Gram positivas o peptidioglicano representa de 15 a 50% da massa seca da célula, nas Gram negativas ele representa no máximo 5%.

Essas informações são importantes, pois é a quantidade de interligações existentes entre as cadeias de peptidioglicano e o comprimento dessas cadeias que determinará a forma da célula, e conseqüentemente, a forma da bactéria.Tanto as Gram positivas quanto as Gram negativas possuem, no entanto, uma característica em comum: suas membranas são constituídas de uma bicamada fosfolipídica.