Como afirmado em meu artigo anterior “A Importância da Identificação Bacteriana em Salas Limpas”, nós devemos identificar a microbiota obtida de amostras ambientais, e isto não está limitado aos ambientes de salas limpas. Neste artigo, eu vou focar na identificação de bactérias somente.

Há vários métodos de identificação bacteriana disponíveis, os quais podem ser classificados em dois grandes grupos: o grupo fenotípico e o grupo genotípico. O grupo fenotípico inclui:
  • Testes bioquímicos
  • Biotipagem
  • Sorotipagem
  • Fagotipagem
  • Suscetibilidade antimicrobiana
  • Eletroforese Enzimática Multi-Local, do inglês Multi-Locus Enzyme Electrophoresis (MLEE)
  • Tipagem eletroforética de proteínas e imuno-blotting
  • Cromatografia Gasosa de Ésteres Metílicos de Ácidos Graxos
O grupo genotípico inclui:
  • Tipagem de plasmídeos
  • Análise de Enzimas de Restrição, do inglês Restriction Enzyme Analysis (REA)
  • Eletroforese em Gel por Campo Pulsado, do inglês Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
  • Ribotipagem
  • Análise de DNA polimórfico Amplificado Aleatoriamente
  • Rep-PCR
  • PCR-ribotipagem 
O único sistema de cromatografia gasosa (CG) disponível comercialmente dedicado à identificação bacteriana por análise de Ésteres Metílicos de Ácidos Graxos (FAME, do inglês Fatty Acid Methyl Ester) é o Sistema de Identificação Microbiana (SIM) Sherlock, desenvolvido pela Microbial ID, Inc. (MIDI). O banco de dados original para identificação de bactérias aeróbicas foi desenvolvido por M. Sasser, em 1990.

O princípio do método FAME se baseia no conceito de que alguns microrganismos possuem composições típicas de ácidos graxos celulares, os quais podem ser comparados à composição típica de ácidos graxos das cepas usadas para criar a biblioteca. Após comparação, as identificações dos microrganismos desconhecidos são determinadas.

Por muitos anos, a análise de ácidos graxos de cadeia curta (ácidos graxos voláteis, AGVs) tem sido rotineiramente utilizada na identificação de bactérias anaeróbicas. Em vários artigos científicos, os ácidos graxos entre 9 e 20 carbonos também têm sido usados para identificação bacteriana, especialmente microrganismos Gram negativos não fermentadores. Com o advento das colunas capilares de sílica fundida (que permite a recuperação de hidróxi ácidos e a resolução de muitos isômeros), se tornou prático e mais fácil utilizar CG de ésteres metílicos de ácidos graxos de células íntegras para identificar culturas microbianas puras e isoladas, bactérias de importância médica e em estudos taxonômicos.

O método FAME utiliza um procedimento específico de preparação de amostra e um sistema cromatográfico sofisticado para fornecer perfis de composição de ácidos graxos reprodutíveis qualitativamente e quantitativamente.

Procedimento de Preparação da Amostra

As bactérias selecionadas para identificação por FAME são repicadas duas vezes em Trypticase Soy Broth solidificado com 1,5% de Agar e então incubadas aerobicamente a 28 ºC por 24 h. O crescimento é examinado quanto à presença de culturas puras e submetido à extração de ácidos graxos em cinco etapas básicas e simples, resumidas na figura abaixo.


  • Reagente 1:NaOH P.A. em Metanol HPLC 
  • Reagente 2: HCl 6,0 N P.A. em Metanol HPLC 
  • Reagente 3: hexano HPLC em metil-terc-butil-éter HPLC 
  • Reagente 4: solução aquosa de NaOH P.A. 
Todas as vidrarias devem ser novas e somente Teflon e vidro deve entrar em contato com os reagentes.

Sistema Cromatográfico

O reconhecimento de perfis de ácidos graxos é realizado utilizando o sistema SIM junto com uma biblioteca padrão. O SIM consiste de um cromatógrafo gasoso equipado com uma coluna capilar de sílica fundida, um detector de ionização de chamas, um integrador e um amostrador automático acoplado com um sistema computadorizado. O software Sherlock automaticamente ajusta os parâmetros operacionais do cromatógrafo gasoso cada vez que uma amostra é processada. Os ácidos graxos são separados devido aos diferentes tempos de retenção, utilizando ar sintético, gás hidrogênio como carreador e gás nitrogênio como gás de compensação (“make up”).

Acoplado ao Sherlock está o software ChemStation utilizado para efetuar amostragens, análises e integração das amostras cromatográficas. As porcentagens cromatográficas são automaticamente calculadas e após comparação com a biblioteca padrão MIDI, as identificações bacterianas são expressas como gênero, espécie e sub-espécie.

Se você quiser saber mais sobre identificação bacteriana por cromatografia gasosa, eu recomendo a leitura deste livro ou visitar o site oficial.