Microbiologia Online

Apesar de descrita há mais de 200 anos (1884) por Christian Gram, a coloração de Gram é uma ferramenta rápida e barata de diagnóstico do tipo de parede celular da bactéria em estudo, ainda amplamente utilizada.

1. Preparar uma lâmina de vidro com uma fina camada de bactérias fixa (esfregaço);
2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
3. Cobrir com lugol por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
4. Descorar com solução de álcool-acetona por 30 segundos. Enxaguar em água corrente;
5. Contra-corar com safranina (ou fucsina) por 30 segundos. Enxaguar em água corrente.
6. Deixar secar ao ar.

 Uma bactéria é dita Gram negativa quando sua parede celular é incapaz de reter o corante cristal violeta, sendo corada somente pela safranina ou fucsina, que empresta sua coloração rosa às bactérias.

Já a parede celular de uma bactéria Gram negativa é mais complexa. É formada por uma ou poucas camadas de peptidioglicano e por uma membrana externa, separadas entre si por um espaço periplásmico, contendo uma série de enzimas e proteínas. Enquanto nas Gram positivas o peptidioglicano representa de 15 a 50% da massa seca da célula, nas Gram negativas ele representa no máximo 5%.

Essas informações são importantes, pois é a quantidade de interligações existentes entre as cadeias de peptidioglicano e o comprimento dessas cadeias que determinará a forma da célula, e conseqüentemente, a forma da bactéria.Tanto as Gram positivas quanto as Gram negativas possuem, no entanto, uma característica em comum: suas membranas são constituídas de uma bicamada fosfolipídica.

De maneira geral, a microscopia de fluorescência é muito semelhante à microscopia ultravioleta. A microscopia de fluorescência se baseia na propriedade que algumas substâncias possuem de emitirem fluorescência após absorverem energia ultravioleta. Em microbiologia, os microrganismos podem ser corados com um corante fluorescente, como o fluorocromo, para produzirem imagens fluorescentes ao microscópio UV.

A principal aplicação da microscopia de fluorescência em microbiologia é a técnica de identificação de reações imunológicas, ou seja, de reações antígeno-anticorpo. O fluorocromo se conjuga com o anticorpo e torna possível identificar células individuais que reagem com o anticorpo, através da emissão de fluorescência. Esta técnica é chamada de imunofluorescência.

Na imunofluorescência, uma cultura de células bacterianas é incubada com um anticorpo, o qual está conjugado com um corante fluorescente. Este conjugado antígeno-anticorpo poderá recobrir a superfície de algumas células, enquanto outras permanecerão sem o conjugado. Com o uso de luz ultravioleta, somente as células recobertas com o conjugado antígeno-anticorpo produzirão fluorescência e aparecerão brilhantes ao microscópio.

Créditos da imagem: Olympus Microscopy Resource Center - http://www.olympusmicro.com/

Próximo artigo: microscopia de contraste de fase.

Como visto anteriormente, em “Princípios dos Microscópios e Microscopia (Parte I)”, a microscopia luminosa se divide em seis subcategorias: microscopia de campo claro, microscopia de campo escuro, microscopia ultravioleta, microscopia de fluorescência, microscopia de contraste de fases e contraste de interferência diferencial (CID).

A microscopia ultravioleta é assim chamada por utilizar luz ultravioleta ao invés de luz branca comum, ou luz visível, como fonte de luz. A luz ultravioleta possui um comprimento de onda de 180 a 400 nm, muito menor que a luz visível, que é de 400 a 700 nm. Qual a vantagem?

Vamos recordar como se calcula o poder de resolução:


De acordo com a equação acima, quanto menor o comprimento de onda, menor o poder de resolução, o que significa que você conseguirá observar objetos ainda menores através do microscópio. Sendo assim, é possível concluir que a microscopia ultravioleta permite um aumento útil de cerca de duas vezes o aumento da microscopia de campo claro.

Além da vantagem de um aumento maior, com nitidez, a microscopia ultravioleta também possibilita a observação de substâncias que foram absorvidas pelos microrganismos e se tornam visíveis quando a luz ultravioleta incide sobre elas, geralmente se tornando fluorescentes. Esta é a principal aplicação da microscopia ultravioleta, ou seja, histoquímica.

O microscópio ultravioleta é diferente do microscópio convencional, pois uma vez que as radiações ultravioletas não são visíveis, as imagens são gravadas em um filme fotográfico, pelo uso de um tubo conversor de imagem ou pela projeção numa tela, depois de a imagem ser captada por um fototubo. Além disso, a microscopia ultravioleta necessita de lentes especiais para transmissão de luz ultravioleta e recursos ópticos para refletir a região de interesse, 230 a 350 nm.



Não perca o próximo artigo: microscopia de fluorescência.